内部开发和验证套件——哪个更好?

研究人员使用免疫分析来确定目标抗原的存在，并量化抗原浓度以供实验使用。这些分析必须既准确又精确，以便对所收集的数据有信心。相关抗体必须表现出较高的结合特异性和亲和力，以确保结果的准确性和最大限度地减少交叉反应。尽管抗体在研究、诊断和临床试验中被广泛使用，但在应用程序中实施抗体之前，没有标准指南来验证抗体。

不幸的是,一些商业生产的抗体没有得到充分的验证。如果没有适当的验证，研究人员可能会得到不一致的结果，并产生容易被误解的扭曲数据。因此，重要的是，研究人员要意识到使用未经测试的公司的试剂盒所涉及的固有风险。

免疫分析中的抗体是如何验证的?

抗体在免疫分析中的验证是通过结合特异性、应用中的结合特异性、结合亲和力和再现性的多参数分析来进行的。

• 结合特异性

结合特异性是指抗体区分抗原并与目标抗原结合而忽略其他抗原的能力。抗体可能对感兴趣的蛋白质敏感，但与样品中存在的其他蛋白质发生交叉反应。首先，关键是要了解用于创建抗体的免疫原类型以及目标蛋白在样本中的结构。例如，针对合成肽产生的抗体可能无法与天然蛋白结合，而针对纯化蛋白产生的抗体在变性时可能无法结合。

结合特异性可以通过正确使用控件来确定。只有阳性对照的验证并不能确保结合的可靠性，因为几个蛋白质可能具有相似的表位，或者一个抗体可能具有多个表位。使用密切相关的蛋白作为阴性对照可能是有用的，但多克隆抗体在不同批次的表位结合中容易发生转移。因此，无论是阳性控制还是阴性控制单独使用都是不够的，它们必须一起使用。阳性对照的最佳类型是转染了相关蛋白的非表达细胞。最好的阴性对照类型是敲除细胞，它不表达感兴趣的蛋白质。

• 应用中的绑定特异性

在证明一种抗体具有高度特异性之后，下一步就是确保它在用于预期应用时具有特异性。不同的免疫分析平台具有不同的表面结构，因此所选择的平台会影响分析的结果。一些商业检测对一种类型的应用显示高结合特异性，但对其他类型的应用则没有。

免疫沉淀允许研究人员使用与蛋白质结合的抗体从溶液中沉淀出蛋白质抗原。同时，质谱(MS)是一种高灵敏度的技术，用于识别和定量大样本中的蛋白质，特别是基于氨基酸修饰的抗体。

目前有两种基于ms的抗体评估方法。第一种方法是通过提高针对其他蛋白质的抗体来评分IP抗体质量，并对产生的沉淀物使用MS来量化拉低目标的抗体。第二种方法是使用尺寸排除色谱法对细胞蛋白进行分离，生物素化和免疫沉淀，每种类型与不同的珠粒颜色相关，然后在流式细胞仪中运行珠粒，通过颜色和与链霉亲和素信号结合的蛋白量来识别抗体。

• 亲和力

结合亲和力是指抗体与靶表位结合的强度。由于单克隆抗体具有同质性和对单个同位素的选择性，因此可以高精度地测定单克隆抗体的结合亲和力。但是，只能得到一个平均的亲和度多克隆抗体由于混合抗体的存在。检测抗体亲和力的方法有几种，包括基于elisa的方法、微尺度热泳入法(MST)和表面等离子体共振法(SPR)。

• 基于elisa的方法是最受欢迎的，包括在溶液中培养抗体浓度和抗原，直到达到稳定阶段。ELISA试剂盒允许研究人员测量未结合抗体的浓度。
• MST通过使用红外激光和荧光来测量分子如何沿着微观温度梯度移动。当以红外激光为目标时，分子结合导致梯度上的运动改变。
• SPR利用光学探测器探测分子间的相互作用。在这种方法中，来自金属涂层表面的光在固定在玻璃棱镜中的抗体和溶液中的抗原之间反射，然后研究人员分析反射角度的变化，以确定是否发生了结合。
• 抗体再现性

在不同批次中使用同一抗体应产生相似的结果。可重复性对所有应用都至关重要，但研究人员发现，当使用现成的免疫测定试剂盒时，从同一家公司订购多套抗体并不总是得到相同的结果。这与多克隆抗体尤其相关，因为供应商经常使用相同的目录编号对不同的抗体进行分类。

从可靠的公司选择有效的工具包

内部设计和验证免疫分析涉及多个因素，这是一个昂贵、具有挑战性和耗时的过程。对于研究人员来说，商业化的现成免疫测定方法可以减少劳动密集型，更具成本效益。然而，一般制造商的产品提供不同程度的验证，并且可能在多个应用程序中提供不同的结果。

最终，对于许多研究人员来说，最好的解决方案是与经验丰富、可靠的公司合作，该公司可以通过使用现有试剂或开发新试剂来定制他们的试剂盒。这些公司允许研究人员确保测定方法得到充分验证，保持对测定结果的控制，并在减少开发时间的同时符合鉴定要求。